دانلود مقاله ميكروسكوپ با فرمت ورد ودر 14 صفحه قابل ویرایش

قسمتی از متن مقاله

ميكروسكوپ يكي از وسايل آزمايشگاهي اصلي در همه ي آزمايشگاه ها است. در اينجا انواع آن مورد بحث و بررسي قرار گرفته و همه نوع ميكروسكوپ به تفصيل معرفي مي شوند.

ميكروسكوپ هاي مختلف داراي بزرگ نمائي هاي متفاوتند كه عموماً با وجود عدسي هاي گوناگون، تصوير نمونه مورد نظر چند برابر مي شود. اصول كلي در تمامي انواع ميكروسكوپ ها براساس عبور نور با طول موج هاي متفاوت از چندين عــدسي محدب است كه هرچقدر طول موج نور به كار رفته در ميكروسكوپ مزبور كوتاه تر باشد قدرت تفكيك و يا جــداكنندگي آن ميكروسكوپ بيشتر است. براي مثال قدرت تفكيك چشم انسان 1/0 ميليمتر است و ميكروسكوپ نوري معمولي 24/0 ميكرون. بيشتر ميکروسکوپ هايي که تاکنون ابداع شده اند، ميکروسکوپ نوري بودند. ميکروسکوپ هاي نوري ميکروسکوپ هايي هستند که براي بررسي يک جسم، از پرتوهاي نور استفاده مي کنند و نور را به جسم موردنظر مي تابانند. با اين همه ميکروسکوپ نوري يک ضعف عمده دارد که محدوديت قدرت تفکيک آن است.
به دليل ماهيت موجي نور، موج هاي مختلف موجود در يک پرتو نور، با يکديگر تداخل مي کنند. به همين دليل، وقتي با استفاده از عدسي يک پرتو نور را متمرکز مي کنيم، بسته به طول موج نور و زاويه يي که عدسي مي تواند نور را جمع کند، يک نقطه نوراني به پهناي 200 نانومتر در جهت هاي X و Y و عمق 500 نانومتر در راستاي Z تشکيل مي شود. در دهه 1930 انواع ميکروسکوپ هاي الکتروني ابداع شد. هر چند اين ميکروسکوپ ها همچنان گران است، اما استفاده از آنها متداول شد. با ابداع ميکروسکوپ هاي الکتروني(که از پرتوهاي الکترون به جاي پرتو نور استفاده مي کند) قدرت تفکيک به شدت افزايش يافت، زيرا طول موج پرتوهاي الکترون کمتر از طول موج فوتون است. فوتون «ذره» تشکيل دهنده نور است. هر چند با ابداع ميکروسکوپ هاي الکتروني دنياي کاملاً تازه اي از جزئيات به روي ما باز شد که پيش از آن مشاهده نکرده بوديم، اما استفاده از آن براي تصويربرداري از نمونه هاي زيستي چندان مناسب نيست. براي آنکه بتوانيم نمونه اي را با استفاده از ميکروسکوپ الکتروني مشاهده کنيم، بايد نمونه ها را در خلأ و به دور از هوا نگهداري کرد. علاوه بر اين پيش از اين که بتوان جسم را زير ميکروسکوپ تماشا کرد، بايد با استفاده از روش هايي آن را آماده کرد. از جمله برش جسم به لايه هاي نازک با استفاده از فلزهايي مثل اورانيوم و سرب يا پوشاندن نمونه با انواع فلزهاي رسانا. در هر مورد، ماده زيستي شناختي مشاهده شده به وسيله ميکروسکوپ الکتروني ديگر زنده نيست. هر چند ميکروسکوپ الکتروني در زيست شناسي و پزشکي کاربردهاي فراواني دارد، اما مطلوب آن است که بدون کشتن نمونه ها بتوانيم قدرت تفکيک را زياد کنيم گرچه سلول هاي انسان ها و حيوانات به قدر کافي بزرگ است و مي توان با استفاده از ميکروسکوپ هاي نوري آنها را مشاهده کرد. درک اين مکانيسم ها در پژوهش هاي پزشکي و ابداع روش هاي درماني جديد بسيار ضروري است.

تقسيم بندي انواع ميكروسكوپ
²ميكروسكوپ هاي نوري
منبع نور در اين ميكروسكوپ نور مرئي است و از چندين عدسي محدب كه در آن تعبيه شده است و نيز يك منشور كه مسير نور را تغيير مي دهد عبور مي کند( قدرت تفكيك 24/0 ميكرون ).
ميكروسكوپ نوري زمينه روشن: قسمت هاي مهم يك ميكروسكوپ نوري عبارتند از:
P عدسي چشمي: اين عدسي براي مطالعه و مشاهده تصوير است.
P عدسي شيئي: اين عدسي براي بزرگنمايي است و شامل چهار عدسي است:
الف) عدسي شماره 4 (عدسي كوچك)
ب) عدسي شماره 10 (عدسي خشك)
ج) عدسي شماره 40 (عدسي خشك)
د) عدسي شماره 100 (عدسي روغني)
P كندانسور: كندانسور نور را جمع كرده و آن را به طور مستقيم روي نمونه هدايت مي كند.
P ديافراگم: مقدار نور ورودي را كم و زياد مي كند.
P ماكرومتر: ماكرومتر صفحه ميكروسكوپ را بالا و پايين برده و براي پيدا كردن تصوير نمونه به كار مي رود.
P ميكرومتر: تصوير تنظيم شده را واضح تر كرده و آن را براي مشاهده مشخص تر مي كند.
بين عدسي شيئي (عدسي 100) و نمونه فاصله اي در حدودmm 1/8 وجود دارد كه اين فاصله را فاصله كانوني گويند و با روغن امرسيون اين فاصله را پر مي كنند. در غير اين صورت به علت وجود هوا و شكست نور عبوري از نمونه، تصوير ناواضح خواهد بود.

² ميكروسكوپ ماوراء بنفش
(Ultra Violet Microscope)
ميكروسكوپ ماوراء بنفش يا ميكروسكوپ U.V كه منبع تغذيه آن نور اشعه U.V است. نسبت به ميكروسكوپ نوري معمولي قدرت تفكيك بالاتري داشته چراكه اشعه ماوراء بنفش طول موج كوتاه تري نسبت به نور مرئي دارد. عدسي شيئي به كار رفته در اين ميكروسكوپ از جنس كوارتز است. به دليل مضر بودن اشعه ماوراء بنفش براي چشم انسان، از تصوير شيء عكسبرداري شده و سپس بر روي صفحه مانيتور قابل مشاهده است ( قدرت تفكيك 600 آنگستروم).

² ميكروسكوپ فلورسانس (Fluorescence Microscope)
انواع خاصي از ميکروسکوپ نوري که منبع نور آن پرتوهاي فرابنفش است. براي مشاهده نمونه زير اين ميکروسکوپ ها بخش ها يا ملکول هاي ويژه داخل سلول با مواد فلورسانت يا نورافشان رنگ آميزي مي شوند. زماني که هدف، تشخيص پروتئين هاي خاص يا جايگاه آنها در سلول باشد، روش هاي معمولي رنگ آميزي که پروتئين ها را به طور عام رنگ مي کنند قابل استفاده نيست. براي رنگ آميزي اختصاصي، معمولا از پادتن هاي اختصاصي متصل به مواد فلورسانت استفاده مي شود. مواد فلورسانت نور را در طول موج فرابنفش جذب مي کنند و در طول موج بلندتري در طيف مرئي تابش مي کنند. تصويري که ديده مي شود حاصل نور تابش شده از نمونه است. رودامين و فلورسئين دو نوع از رنگ هاي معمول فلورسانت هستند که به ترتيب نور قرمز و سبز از خود تابش مي کنند.

کارکرد ميکروسکوپ هاي فلورسانس
در ابتداي قرن بيستم پديده فلورسانس در ساخت ميکروسکوپ به کار گرفته شد. فلورسانس يکي از پديده هاي مربوط به نورتابي (لومين سانس) است. ما معمولاً وقتي جسمي را مي بينيم که نور از آن جسم بازتاب مي شود. رنگ جسم نيز به اين موضوع وابسته است که جسم چه طول موجي را بازتاب مي کند. در پديده فلورسانس مولکول يک فوتون (يک ذره نور) با طول موج خاص را جذب و سپس آن را با طول موج بلندتري منتشر مي کند. فلورسانس يکي از روش هاي بسيار متداول در تصويربرداري بافت هاي زيست شناختي است. مواد زيست شناختي معمولاً نور را به شدت متفرق مي کنند و در نتيجه تماشاي آن وراي سطح سلول دشوار است. در پديده فلورسانس معمولاً طول موج نور گسيل شده از طول موج نور تابيده شده بيشتر است، بنابراين نور متفرق شده از سطح سلول را مي توان از نور تابيده شده به سلول تفکيک کرد. براي انجام اين کار از آينه هاي دورنگي استفاده مي کنند. اين آينه ها نور تابيده شده را دوباره به نمونه برمي گردانند، اما نور فلورسانس از آن عبور مي کند، در نتيجه تماشاي ساختارهاي دروني سلول امکان پذير مي شود. برخي مواد زيست شناختي به طور طبيعي فلورسنت است، اما رنگ ها و پروتئين هاي فلورسنت فراواني نيز وجود دارد که مي توان از آنها براي رنگ آميزي بخش هاي ويژه يک سلول مثل هسته استفاده کرد. حتي مي توان آنها را به پروتئين هاي خاص درون سلول متصل کرد، در نتيجه پي گيري حرکت آنها درون سلول امکان پذير مي شود. استفاده از رنگ ها و پروتئين هاي نور کليد زدني فلورسنت که به تازگي کشف شده است، کاربردهاي بسياري در تصويربرداري فلورسانس دارد. اين مولکول ها مي توانند دو حالت داشته باشند، يک حالت درخشان يا حالت فلورسنت و يک حالت تاريک يا غيرفلورسنت. کليدزني بين اين دو حالت با تاباندن نور با دو طول موج متفاوت انجام مي شود.
يکي از کاربردهاي مولکول هاي نور کليدزدني رديابي پروتئين ها است. اگر مولکول هاي فلورسنت به پروتئين هاي خاص متصل شوند و يک بخش کوچک از آنها فعال شود، پي گيري جابه جايي پروتئين ها بسيار آسان تر از حالتي است که همه پروتئين هاي درون سلول نور را گسيل کنند. علاوه بر اين لحظه دقيق فعال سازي را مي توان کنترل کرد.
به طوركلي مواد از لحاظ خاصيت فلورسانس دو نوعند:
P فلورسانس اوليه كه اين مواد ذاتاٌ خاصيت فلورسانس دارند يعني از خود نور ساطع مي كنند مثل ويتامين ها و رنگ ها.
P فلورسانس ثانويه كه از خود خاصيت فلورسانسي نداشته و با رنگ آميزي و معرف هاي گوناگون از قبيل سولفات بربرين و نارنجي آكريدين خاصيت فلورسانسي را به آنها القا مي كنيم.
منبع تغذيه نور در اين ميكروسكوپ اشعه U.V است. در اينجا نيز از تصوير شيء عكس برداري شده كه بر روي صفحه مانيتور قابل مشاهده است.

² ميكروسكوپ زمينه سياه (Dark Field Microscope)
مطالعه سلول هاي زنده با اين ميكروسكوپ ها نيز مقدور است. سيستم هاي نوري خاصي در تمام اين نوع ميكروسكوپ ها وجود دارد كه تباين كافي بين اجزاي سلول ايجاد كرده، مشاهده سلول هاي زنده را مقدور مي سازند.
در ميكروسكوپ زمينه سياه، نور حامله از منبع نوري به شكل مخروط در مي آيد و انوار از اطراف به نمونه تابيده مي شود. اين كار توسط كندانسور خاص اين ميكروسكوپ انجام مي گيرد. در نتيجه تصوير نمونه به صورت روشن در يك زمينه تاريك مشاهده مي شود. استفاده از ميكروسكوپ زمينه سياه براي مشاهده حركت باكتري معمول است (مثل اسپيروكت تروپون ها پاليدوم عامل بيماري سيفيليس).
منبع تغذيه نور در اين نوع ميكروسكوپ نور مرئي است و با ايجاد انكسار نور توسط آئينه هاي محدب و مقعر شيء يا نمونه مورد بررسي، شفاف و نوراني در زمينه سياه ديده مي شود.

² ميكروسكوپ اختلاف فاز (Phase Contrast Microscope)
مزيت ميکروسکوپ اختلاف فاز در اين است که مي توانيم با آن سلول هاي زنده را با جزئيات بيشتر مشاهده کنيم. تيمارهايي مثل تثبيت نمونه مي توانند دگرگوني هايي در ساختار دروني سلول به وجود آورند. بنابراين مطالعه سلول هاي زنده که هيچ تيماري نديده اند خيلي مطلوب است. مي توان فرايند هايي مثل تقسيم ميتوز(mitosis) در سلول هاي زنده را نيز با اين ميکروسکوپ ها مطالعه کرد. در برخي موارد براي عکس برداري پيوسته و دراز مدت از سلول فعال، دوربيني به ميکروسکوپ وصل مي شود. مطالعه سلول هاي زنده با ميکروسکوپ تداخلي(interference microscope) و ميکروسکوپ زمينه سياه(dark field microscope) نيز مقدور است. سيستم هاي نوري خاصي در تمام اين نوع ميکروسکوپ ها وجود دارد که به علت ويژگي آنها تباين کافي بين اجزاي سلول ايجاد و مشاهده ي سلول هاي زنده مقدور مي شود. استفاده از ميکروسکوپ زمينه سياه براي مشاهده ي حرکت باکتري معمول است که در اين مورد ايجاد تباين بين سلول باکتري زنده و محيط اطرافش مهم است.
مزيّت ميكروسكوپ اختلاف فاز در اين است كه مي توانيم با آن سلول هاي زنده را با جزئيات بيشتر مشاهده كنيم. تيم هايي مثل تثبيت نمونه مي توانند دگرگوني هايي در ساختار دروني سلول به وجود آورند. بنابراين مطالعه سلول هاي زنده اي كه هيچ گونه تيماري نديده اند خيلي مطلوب است. مي توان فرآيندهايي مثل تقسيم ميتوز در سلول هاي زنده را نيز با اين نوع ميكروسكوپ ها مطالعه كرد. در برخي موارد، براي عكس برداري پيوسته و دراز مدت از سلول فعال، دوربين به ميكروسكوپ وصل مي شود.
در ميكروسكوپ اختلاف فاز، نور حاصله از منبع نوري به انوار مختلف شكسته شده و شكسته نشده تقسيم مي شود. اين كار توسط ديافراگم مخصوص اين ميكروسكوپ انجام مي گيرد. انواري كه مي شكنند به جسم يا نمونه نفوذ نمي كنند اما انواري كه نمي شكنند به جسم يا نمونه نفوذ مي كنند در نتيجه بين نمونه و محيط اطراف آن اختلاف به وجود مي آيد و نمونه به صورت شفاف ديده مي شود.
منبع تغذيه نور در اين نوع ميكروسكوپ نور مرئي است و براي بررسي بافت ها يا نمونه هايي كه اختلاف انكساري نوري كمي دارند مورد استفاده قرار مي گيرد. بدين منظور صفحه سوراخ داري به نام پلاك فاز در كندانسور تعبيه مي شود.

² ميكروسكوپ الكتروني
(Electron Microscope)
قدرت جداسازي ميکروسکوپ الکتروني از ميکروسکوپ نوري بهتر است به اين معني که با ميکروسکوپ الکتروني اجزاي کوچک تري را مي توان ديد. قبلا گفته شد حد تفکيک (R) به طول موج نوري بستگي دارد که به نمونه مي تابد. در حقيقت بين اين دو رابطه مستقيمي وجود دارد يعني هر چقدر طول موج تابشي کوچک تر باشد، R نيز کوچک تر و قدرت جداسازي بيشتر است. در ميکروسکوپ الکتروني به جاي استفاده از نور مرئي از امواج الکترون ها استفاده مي شود. در شرايط مناسب طول موج الکترون ها به nm 0/005 مي رسد. در اين طول موج بهترين R ممکن حدود nm 0/002 است. در عمل به علت محدوديت هاي ديگر، قدرت جداسازي ميکروسکوپ هاي الکتروني هيچ وقت به اين خوبي نيست. حد تفکيک با ميکروسکوپ الکتروني براي ملکول هاي تخليص شده ي زيستي، حدود 0/1 نانومتر و براي سلول ها 2 نانومتر است که دست کم 100 برابر بهتر از بهترين ميکروسکوپ هاي نوري است.
دو نوع ميکروسکوپ الکتروني به نام ميکروسکوپ الکتروني گذاره و ميکروسکوپ الکتروني نگاره وجود دارد. ميکروسکوپ الکتروني گذاره (transmission electron microscope) زودتر اختراع شد و قدرت جداسازي بهتري دارد. در اين نوع ميکروسکوپ، الکترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخي مناطق آن عبور مي کنند و از مناطقي ديگر بازتابيده مي شوند. عامل تعيين کننده در اين امر در نهايت ويژگي اتم هاي تشکيل دهنده مناطق مختلف سلول است. الکترون هاي عبوري در دستگاه تشخيص داده مي شوند و تصويري از نمونه حاصل مي شود. سلول هاي زنده با ميکروسکوپ الکتروني قابل مشاهده نيست.
يكي از تجهيزات بزرگ علمي ميكروسكوپ الكتروني است كه براساس قوانين نوري كار مي كند دراين دستگاه شار الكترون پر انرژي از يك منبع الكترون خارج شده وتحت شتاب به طرف هدف مي رود در مسير خود از روزنه هاي تعبيه شده در يك فلز عبور كرده وبا عبور از لنزهاي مغناطيسي بر روي شي مورد نظر تابانده شده ودر نتيجه بازتاب نور تصوير شي ديده خواهد شد.
اطلاعاتي را كه ميكروسكوپ الكتروني ارائه مي دهد:
P توپوگرافي شئ: (نقشه برداري) كه با آشكار كردن مشخصات سطح و بافت داخلي شئ مي توان به خواصي مانند سفتي و ميزان ار تجاعي بودن آن پي برد.
P مورفولوژي (ريخت شناسي): از آن رو كه در اين رويت شكل و سايز ذرات مشخص است مي توان به سختي و استحكام پي برد.
P تركيب: اين ميكروسكوپ مي تواند عناصر سازنده شئ را مشخص کند. بنابراين مي توان به خواصي مانند نقطه ذوب اكتيويته شئ نيز دست يافت.
P بلور شناسي: ميكرو سكوپ الكتروني چگونگي چيده شدن اتم ها را در مجاورت يكديگر مي دهد وبه اين تر تيب مي توان آنها را از نظر رسانايي و خواص الكتريكي بررسي کرد.
پيشرفته ترين ميكروسكوپ قرن حاضر، با قدرت تفكيك 2 آنگستروم است. در اين ميكروسكوپ با عبور پرتوهاي الكتروني ساطع شده از رشته سيمي تنگستن با طول موج بسيار پائين از عدسي هاي متعدد كه در نهايت بر روي يك صفحه فلورسنت يا صفحه مانيتور، عكسبرداري صورت گرفته و تصوير شيء قابل مشاهده است.
قدرت جداسازي ميكروسكوپ هاي الكتروني از ميكروسكوپ نوري بهتر است به اين معني كه با ميكروسكوپ هاي الكتروني اجزاي كوچك تر را مي توان ديد. قبلاً گفته شد كه بين R و طول موج نور تابيده شده به نمونه رابطه مستقيمي برقرار است، يعني هر چقدر طول موج تابشي كوچك تر باشد، R نيز كوچكتر و قدرت جداسازي بيشتر است. طول موج نور مرئي بين mm300 تا 800mm و بهترين حد تفكيك ميكروسكوپ هاي نوري 200nm است.
در ميكروسكوپ هاي الكتروني به جاي استفاده از امواج نور مرئي، از امواج الكترون ها استفاده مي شود. در شرايط مناسب، طول موج الكترون ها به 0/005 نانومتر مي رسد، يعني حدود 000/100 برابر كوتاه تر از طول موج نور مرئي. در اين طول موج، بهترين R ممكن حدود 0/002 نانومتر است. در عمل، به علت محدوديت هاي ديگر، قدرت جداسازي ميكروسكوپ هاي الكتروني هيچ وقت به اين خوبي نيست. حد تفكيك (R) با ميكروسكوپ الكتروني براي مولكول هاي تخليص شده زيستي، حدود nm0/1 و براي سلول ها حدود 2nm است كه دست كم صد برابر بهتر از ميكروسكوپ هاي نوري است.
دو نوع ميكروسكوپ الكتروني بنام هاي ميكروسكوپ الكتروني گذاره و ميكروسكوپ الكتروني نگاره وجود دارد.

P ميكروسكوپ الكتروني گذاره
اين ميكروسكوپ زودتر اختراع شده و قدرت جداسازي بهتري دارد. در اين نوع ميكروسكوپ، الكترون ها هنگام برخورد به نمونه از برخي مناطق آن عبور مي كنند و از مناطقي ديگر بازتابيده مي شوند. الكترون هاي عبوري در دستگاه تشخيص داده مي شوند و تصويري از نمونه حاصل مي شود. جزئيات روش هاي تثبيت، برش گيري و رنگ آميزي براي ميكروسكوپ الكتروني اختصاصي است. به عنوان مثال، براي رنگ آميزي نمونه از فلزات سنگين مانند طلا استفاده مي شود تا الكترون ها از اندامك ها و ساختارهاي درون سلولي، مثل ريبوزوم و مولكول هاي بزرگ سلول مثل DNA، با ميكروسكوپ الكتروني گذاره قابل تشخيص هستند، اما جايگاه اتم هاي تشخيص دهنده مولكول ها معمولاً تعيين نمي شود.