میکروب‌شناسی

فصل اول: ساختار سلول‌های یوکاریوتی و پروکاریوتی، طبقه بندی، ساختمان و فیزیولوژی میکروارگانسیم ها

تاریخچه

اولين بار آنتون ليون هوك در سال 1674 با عدسي ساده خود ميكروارگانيسم هايي را در يك قطره آب مشاهده كرد و دنياي موجودات ذره بيني را دنياي حيوانات كوچك (animacules) ناميد.

در سال 1800 Semelwise دزانفکته کردن با کلر جلوی انتشار بیماری را می گیرد.

اواسط 1800 Snow بیان کرد آب در انتقال برخی بیماری ها

حدود يكصد سال بعد زيست شناس دانماركي بنام اتومولر (Otto Muller) باكتري ها را بر اساس روش طبقه بندي كرلوس لينه به جنس ها و گونه ها تقسيم نمود.

سپس فردريش هنله آسيب شناس آلماني، نقش ميكروارگانيسم ها را در بيماري هاي انساني اثبات كرده و تئوري جرم در بيماري ها را مطرح كرد.

در سال 1888 توکسین دیفتری (اولین توکسین کشف شده) توسط Friedrich Loeffler (1852–1915)



در سال 1850 توکسین (استافیلوکوکوس اورئوس) توسط Edwin Klebs (1834–1913)

توکسین وبا توسط Robert Koch (1843–1910

رابرت كخ و لوئيس پاستور در سال هاي 1870 و 1880 تئوري جرم را با آزمايش هاي بسيار تاييد نموده و ميكروارگانيسم هاي عامل سياه زخم، سل، وبا، هاري و طاعون را شناسايي كردند، همچنين پديده تخمير ميكروبي و توليد اسيد و رابطه آن با توليد سركه توسط كخ اثبات شد.

اوایل قرن 19 توکسین بوتولیسم توسط Justinus Kerner شناسایی شد.

اولين تركيب ضد ميكروبي توسط پاول ارليش (تركيبات نقره بر ضد سيفليس)، كشف شد. الكساندر فلمينگ در سال 1928 پني سيلين و جرهارد دوماگ در سال 1935 سولفاناميد ها را كشف كردند. در سال 1939 چاين و فلوري توانستند پني سيلين را خالص كرده و از آن در درمان باكتري ها استفاده كنند. سپس استرپتومايسين در سال 1943 توسط سلمن واكسمن كشف شد. در سال 1946 ميكروب شناس آمريكايي جان اندرز نخستين بار ويروس ها را در كشت سلولي كشت داد.

در سال 1920 گريفيت نقش محوري DNA را به عنوان مخزن اطلاعات ژنتيك نشان داده و پديده ترانسفورماسيون را كشف نمود. سپس در سال 1940 آوري و كولين مك لين تود مشاهده كردند كه در پنوموكوك پديده ترانسفورماسيون در بيماريزايي نقش دارد. در اوايل سال 1960نيرنبرگ و آكوا ماهيت سه تايي باز هاي RNA را كه با سيگنال هاي كدون اسيدهاي آمينه مطابقت داشتند را نشان دادند. در سال 1993 اولين بار تكنيك توالي يابي ژ‍نومي (DNA sequencing) توسط فردريش سانگر انجام شد.

تفاوت سلول‌های یوکاریوتی و پروکاریوتی: سلول‌های یوکاریوتی از نظر اندازه و پیچیدگی سلول تفاوت‌های عمده‌ای با پروکاریوت‌ها دارند، یک سلول یوکاریوتی شامل یک هسته دو لایه حاوی DNA دو رشته ای خطی، سیتوپلاسم حاوی ارگانل‌هایی چون میتوکندری، کلروپلاست (در سلول گیاهی)، شبکه آندوپلاسمی، دستگاه گلژی، لیزوزوم‌ها، پروکسی زوم و سیتو اسکلت که حاوی میکروفیلامنت‌ها، فیلامان‌های بینابینی و میکرو توبول‌هاست.

به DNA سلول‌های یوکاریوتی هستیون‌ها متصل هستند که ساختار پروتئینی دارند. همچنین هستک حاوی RNA‌های ریبوزومی می‌ باشد که در سنتز ریبوزوم نقش دارند.

میتوکندری حاوی ریبوزو‌ها و DNA حلقوی است که از این نظر شبیه یک سلول پروکاریوتی می‌باشد. در غشای داخلی میتوکندری چرخه‌های متابولیسمی سلول انجام می‌شود.

برخی میکروارگانیسم‌های یوکاریوتی مثل تریکوموناس واژینالیس فاقد میتوکندری بوده و به جای آن ارگانل‌های تنفسی به نام هیدروژنوزوم دارند که حاوی ریبوزوم و DNA می‌باشد. در این ارگانل پیروات گرفته شده و استات، 2H، 2Co و ATP تولید می‌شود.

اعضای حرکتی: بسیاری از سلول‌های یوکاریوتی اعضایی به نام تاژک (مثل تریکوموناس واژینالیس) و مژه (در بالانتیدیوم کلای) دارند. ساختار این اعضا به صورت می‌باشد، چون داراي يك جفت ميكروتوبول محيطي و دو ميكروتوبول مركزي هستند.

انگوري و زنجيره اي (استرپتوكوك) مشاهده مي شوند. انتهاي باسيل ها ممكن است كروي (سالمونلا و اشرشياكلاي) يا بريده و زاويه دار (باسيلوس آنتراسيس) باشد. برخي باسيا ها فوزي فرم (فوزوباكتريوم) بوده و انتهاي نوك تيز دارند يا به شكل ويرگول (ويبريو)، بال مرغ دريايي (كمپيلوباكتر) و خميده اند و يا مارپيچ هاي بلند تشكيل مي دهند (اسپيروكت ها). قارچ ها، ويروس ها و انگل ها نيز جزو ميكروب ها محسوب مي شوند.

مشاهده باكتري ها

انواع ميكروسكوپ براي مشاهده باكتري ها موجود هستند، مثل ميكروسكوپ نوري با قدرت تفكيك 3/. ميكرومتر، ميكروسكوپ فاز كنتراست براي مشاهده كپسول، اندوسپور و ديواره باكتري ها و ميكروسكوپ زمينه تاريك براي مشاهده اسپيروكت ها (مثل تروپونما پاليدوم) .

ميكروسكوپ هاي الكتروني نيز براي مشاهده ساختار سطحي و يا دروني باكتري ها استفاده مي شوند و قدرت تفكيك نوع روبشي تا 20 نانومتر و نوع گذاره بيشتر از آن دارند.

طبقه بندي باكتري ها

الف) بر اساس مورفولو‍ژي و اندازه كه در بالا بحث شد.

ب) بر اساس رنگ آميزي گرم: باكتري ها بر اساس نوع ديواره به گرم مثبت و گرم منفي تقسيم مي شوند. در اين رنگ آميزي با اضافه كردن كريستال ويوله، پپتيدوگليكان باكتري ها رنگ مي گيرد. سپس تركيب يد- دار لگول براي تثبيت اين رنگ اضافه مي شود. رنگ فوشين قلیایی (سافرانین) نيز براي گرم منفي ها بوده و جاي كريستال ويوله كه با الكل- استن شسته شده است را مي گيرد. اين تفاوت در تركيب ديواره موجب تفاوت در حساسيت به آنتي بيوتيك ها و آنزيم ها نيز مي گردد، در باكتري گرم مثبت، پپتيدوگليكان به ليزوزيم و آنتي بيوتيك هاي بتالاكتام (پني سيلين)، حساسيت بيشتري نشان داده و در گرم منفي ها به علت وجود غشاي خارجي، حساسيت به آنتي بادي ها و سيستم كمپلمان بسيار بالاتر است (نایسریا و هموفیلوس).

مايكوباكتريوم ها به دليل پيچيدگي ديواره (مايكوليك اسيد و آرابينوگالاكتان) نسبت به رنگ آميزي گرم مقاوم بوده و رنگ آميزي اسيد فست (زيل نلسون) انجام مي شود. در اين رنگ آميزي براي رنگ بري از اسيد كلريدريك (يا سولفوريك 1 درصد در مورد نوكارديا) استفاده مي شود. برخي تك ياخته ها مثل كريپتوسپوريديوم و كيلوماستيكس نيز با اسيد فست رنگ مي گيرند.

ج) بر اساس ظاهر ماكروسكوپي كلوني: اين ويژگي ها شامل ايجاد هموليز روي بلاد آگار، پيگمانتاسيون كلوني، اندازه و شكل و بوي كلوني ها مي باشند. براي مثال استافيلوكوكوس اورئوس روي بلاد آگار ايجاد كلوني طلايي رنگ مي كند كه از ديگر گونه ها متمايز مي گردد. استرپتوكوك پيوژنز يك باكتري گرم مثبت است كه داراي كلوني هموليتيك كوچك و سفيد رنگ روي پليت آگار خوندار مي باشد. استرپتوكوك آگالاكتيه و ليستريا هموليز اندك و باريك ايجاد كرده كه با تست كمپ در مجاورت استافيلوكوكوس اورئوس تشديد مي شود. كلستريديوم پرفرينجنس هموليز دوگانه شبيه سيبل هدف ايجاد مي كند كه به علت هموليزين هاي تتا (كامل و در مركز) و آلفا (ناقص و خارجي تر) مي باشد. سودوموناس آئروژينوزا كلوني هاي سبز رنگ داشته و بوي ميوه مانند (با توليد تركيب تري متيل آمين) دارد. پاستورلا مولتوسيدا بوي Musty odor (کپک مانند) ايجاد مي كندكه به دليل توليد اندول است. ايجاد كلوني هاي با ظاهر گچي و بوي خاك مانند نيز در نوكارديا آستروئيدس يافت مي شود. كلوني هاي يرسينيا پستيس و كورينه باكتريوم ديفتريه به صورت مضرس و كنگره دار (Folding and snapping) مي باشند.

د) تست هاي بيوشيميايي: رايجترين روش براي شناسايي باكتري ها مي باشند. در اين روش بر اساس تخمير كربوهيدرات ها، استفاده از تركيبات مختلف به عنوان منبع كربن و انرژي و توليد برخي آنزيم ها شناسايي جنس و يا گونه باكتري انجام مي شود.

ه) روش هاي ديگر طبقه بندي فنوتيپيك شامل سروتايپينگ، الگوي آنتي بيوگرام و فاژتايپينگ مي باشند.

سروتايپينگ در مورد باكتري هاي فرانسيسلا، تروپونما پاليدوم، اشرشيا كلي 157O و استرپتوكوك پيوژنز مطرح بوده و براي اهداف اپيدميولوژيك به كار مي رود. فاژتايپينگ يا حساسيت به فاژها روش مشكلي بوده و روش هاي ژنوتيپي جاي آن را گرفته اند.

طبقه بندي آناليتيك بر اساس بررسي ليپيدها، پروتئينهاي باكتريايي و الكتروفورز چند كانوني (MLEE) انجام مي گيرد.

و) طبقه بندي ‍ژنوتيپي: شامل نسبت گوانين+سيتوزين (C+G)، هيبريداسيون DNA، تجزيه و تحليل توالي اسيد نوكلئيك، تجزيه و تحليل پلاسميد، ريبوتايپينگ و تجزيه و تحليل قطعات DNA كروموزومي مي باشد.

ز) بر اساس هوازي و بيهوازي بودن باكتري ها

ا) كوكسي گرم مثبت هوازي: ميكروكوك، استافيلوكوك، آئروكوك، آلويوكوك، لاكتوكوك، لكونوستوك، انتروكوك، پديوكوك و استرپتوكوك

2) باسيل هاي گرم مثبت هوازي: كورينه باكتريوم، گوردونيا، نوكارديا، رودوكوك، تسوكامورلا، مايكوباكتريوم (همگي داراي اسيد مايكوليك)، اكتينومادورا، درماتوفيلوس، نوكارديوپسيس، روتيا، استرپتومايسس (فاقد اسيد مايكوليك)، آركانوباكتريوم، باسيلوس، بروي باكتريوم، اريزيپلوتريكس، گاردنرلا، ليستريا و توريسلا.

3) باسيل، كوكوباسيل و كوكوس هاي گرم منفي هوازي و بيهوازي اختیاری: انتروباكترياسه، ويبريو، آئروموناس، سودوموناس، پاستورلا ، برانهاملا، نايسريا، موراكسلا

4) كوكسي هاي گرم مثبت و منفي بي هوازي: انائروكوك، فاينگولديا، ميكروموناس، پپتو استرپتوكوك (گرم مثبت) و ويلونلا (گرم منفي)

5) باسيل هاي گرم مثبت و منفي بيهوازي: اكتينومايست، بيفيدوباكتريوم، كلستريديوم، يوباكتريوم و لاكتوباسيلوس (گرم مثبت) و باكتريوئيدس، فوزوباكتريوم، پورفيروموناس و پروتلا (گرم منفي).

ساختار سلول پروكاريوتي: اعضاي سلول پروكايوت ساده‌تر از يوكاريوت‌ها بوده ولي از نظر پوشش سلولي پيچيده‌تري دارند. اعضاي سلول پروکاریوتی شامل:

نوكلئوئيد: پروكاريوت‌ها هسته واقعي ندارند و DNA خود را در ساختاري به نام نوكلئوئيد جاي مي‌دهند. اين ناحيه با رنگ‌آميزي فولگن مشاهده مي‌شود. بار الكتريكي DNA منفي بوده و توسط پلي‌آمين‌هاي كوچك و يون‌هاي منيزيوم خنثي مي‌شود. همچنين در پروكاريوت‌ها پروتئين‌هاي ساده‌اي به DNA متصل مي‌شود كه نقش مشابهي با هستيون‌هاي یوكاريوت‌ها به عهده دارند.

سلول‌هاي پروكاريوتي دستگاه ميتوتيك براي تقسيم شدن ندارند ولي گروهي از باكتري‌هاي آبي به نام پلانكتومیست‌ها كه داراي نوكلئوئيد هستند كه توسط غشاي دولايه‌اي احاطه شده است، آن را دارند.

باكتري‌ها داراي يك DNA حلقوي مي‌باشند ولي برخي از جنس‌ها مثل ويبريوها، بروسلاها به جز بروسلا سوئيس (تيپ 3) و بورخولدرياها داراي دو مولكول DNA حلقوي هستند. همچنين برخي باكتري‌ها حاوي DNA خطي مي‌باشند مثل بورليا بورگرورفري، ب. هرمسی و استرپتومايس كوالی كالر.

ساختارهاي سيتوپلاسمي

پلاسميدها: مولكول‌هاي DNA دو رشته حلقوي هستند كه از نظر اندازه متفاوت بوده و به تعداد متفاوتي در باكتري‌ها حضور دارند. پلاسميدها مستقل از كروموزوم همانندسازي مي‌كنند يعني يكرپليكون محسوب مي‌شوند، اگرچه به ندرت وارد DNA كروموزومي شده و قسمتي از آن را مي‌گيرند كه اصطلاحاًاپي‌زوم خوانده مي‌ شوند، در صورتي‌كه قسمتي از كروموزوم با پلاسميد طي فرايند كونژوگاسيون بين دو باكتري مبادله شود، اصطلاحاً گفته مي‌شود سلول HFr حاصل شده است. اين ويژگي در پلاسميد F ديده مي‌شود.